Оптимізація флуоресцентного дослідження ендокринної частини підшлункової залози з використанням методів машинного аналізу

Автор(и)

DOI:

https://doi.org/10.14739/2310-1237.2022.1.254173

Ключові слова:

флуоресцентна мікроскопія, система цифрового аналізу зображень, підшлункова залоза

Анотація

Мета роботи – встановити оптимальні параметри інтенсивності, тривалості безперервного УФ-випромінювання на фотодинамічне знебарвлення досліджуваних тканин підшлункової залози, а також на співвідношення інтенсивності корисного сигналу в зоні дослідження флуоресценції та інтенсивності неспецифічної флуоресценції фону.

Матеріали та методи. Підшлункову залозу трьох дорослих щурів лінії Wistar фіксували в розчині Буена (20 годин) і заливали в парапласт після стандартної гістологічної обробки. Дослідження здійснили на парафінових зрізах підшлункової залози, в яких імунофлуоресцентним методом визначали інсулін і глюкагон у панкреатичних острівцях за допомогою антитіл виробництва Santa Cruz Biotechnology. Реакцію імунофлуоресценції вивчали на мікроскопі AxioImager-M2. Для зйомки флуоресценції використали систему аналізу цифрових зображень AxioVision, а для кількісного аналізу зображення – систему аналізу зображень ImageJ. Проаналізували 30 панкреатичних острівців площею 3000–5000 мкм2 (8–13 % площі кадра).

Результати. Вимірювання, здійснені при постійних величинах концентрації гормонів в ендокриноцитах, показали різну оцінку середньої інтенсивності флуоресценції для інсуліну та глюкагону, що залежала від інтенсивності УФ радіації. З посиленням дії УФ радіації середня інтенсивність флуоресценції для інсуліну та глюкагону збільшувалась, але внаслідок корекції експозиції камери ставала майже однаковою. Незалежно від цього інтенсивність неспецифічної флуоресценції фону монотонно зростала. Використання в розрахунках відношення логарифмів флуоресценції фону препарату та флуоресценції ендокриноцитів дає стійку оцінку відносної концентрації гормонів, що не залежить від інтенсивності обраного режиму УФ радіації, а також від тривалості УФ опромінення препарату. Це дає змогу нівелювати ефект фотодинамічного знебарвлення препарату, спричиненого безперервним УФ опроміненням. Методи машинного виділення ділянки інтересу різними алгоритмами програми ImageJ дають різну оцінку її площі, інтегральної та середньої величини флуоресценції. Результат, наближений до «ідеального» інтерактивного способу виділення ділянки інтересу для інсуліну та глюкагону, показав метод сегментації Оцу.

Висновки. Під час імунофлуоресцентного дослідження підшлункової залози слід обирати помірний режим УФ радіації, корегувати експозицію CCD камери перед кожним кадром, а загальний час дослідження поля зору зразка обмежити 1–2 хвилинами. Для виділення ділянки дослідження інсуліну та глюкагону під час автоматичного аналізу рекомендовано застосовувати алгоритм Оцу. Для отримання кількісної оцінки середньої інтенсивності флуоресценції у сфері дослідження рекомендоване використання в розрахунках відношення логарифмів флуоресценції фону препарату та ендокриноцитів.

Біографії авторів

Т. В. Іваненко, Запорізький державний медичний університет, Україна

канд. мед. наук, доцент каф. патологічної фізіології з курсом нормальної фізіології

А. В. Абрамов, Запорізький державний медичний університет, Україна

д-р мед. наук, професор каф. патологічної фізіології з курсом нормальної фізіології

Посилання

Dunst, S., & Tomancak, P. (2019). Imaging Flies by Fluorescence Microscopy: Principles, Technologies, and Applications. Genetics, 211(1), 15-34. https://doi.org/10.1534/genetics.118.300227

Fang, J., Swain, A., Unni, R., & Zheng, Y. (2021). Decoding Optical Data with Machine Learning. Laser & photonics reviews, 15(2), 2000422. https://doi.org/10.1002/lpor.202000422

Herman B. (2002). Fluorescence microscopy. Current protocols in cell biology, Chapter 4. https://doi.org/10.1002/0471143030.cb0402s13

Lichtman, J. W., & Conchello, J. A. (2005). Fluorescence microscopy. Nature methods, 2(12), 910-919. https://doi.org/10.1038/nmeth817

Campbell-Thompson, M., & Tang, S. C. (2021). Pancreas Optical Clearing and 3-D Microscopy in Health and Diabetes. Frontiers in endocrinology, 12, 644826. https://doi.org/10.3389/fendo.2021.644826

De Boer, P., & Giepmans, B. N. (2021). State-of-the-art microscopy to understand islets of Langerhans: what to expect next?. Immunology and cell biology, 99(5), 509-520. https://doi.org/10.1111/imcb.12450

Dybala, M. P., Olehnik, S. K., Fowler, J. L., Golab, K., Millis, J. M., Golebiewska, J., Bachul, P., Witkowski, P., & Hara, M. (2019). Pancreatic beta cell/islet mass and body mass index. Islets, 11(1), 1-9. https://doi.org/10.1080/19382014.2018.1557486

Starlch, G. H., Zafiroya, M., Jablenska, R., Petkoy P., & Lardinois, C. K. (1991). A morphological and immunohistochemical investigation of endocrine pancreata from obese ob+/ob+ mice. Acta Histochemical, 90(1), 93-101. https://doi.org/10.1016/S0065-1281(11)80167-4

Schneider, B. S., Hastings, H. M., & Maytal, G. (1996). The Spatial Distribution of Pancreatic Islets Follows a Universal Power Law. Proceedings the Royal Society (London), 263, 129-131. https://doi.org/10.1098/rspb.1996.0020

Parween, S., Kostromina, E., Nord, C., Eriksson, M., Lindström, P., & Ahlgren, U. (2016). Intra-islet lesions and lobular variations in β-cell mass expansion in ob/ob mice revealed by 3D imaging of intact pancreas. Scientific reports, 6, 34885. https://doi.org/10.1038/srep34885

Wang, L. J., & Kaufman, D. B. (2016). Digital Image Analysis to Assess Quantity and Morphological Quality of Isolated Pancreatic Islets. Cell transplantation, 25(7), 1219-1225. https://doi.org/10.3727/096368915X689947

Rickels, M. R., & Robertson, R. P. (2019). Pancreatic Islet Transplantation in Humans: Recent Progress and Future Directions. Endocrine reviews, 40(2), 631-668. https://doi.org/10.1210/er.2018-00154

González, R. C., & Woods, R. E. (2018). Digital Image Processing (4th ed.). Pearson Education Limited.

McNamara, G., Difilippantonio, M., Ried, T., & Bieber, F. R. (2017). Microscopy and image analysis. Current Protocols in Human Genetics, 2017, 4.4.1-4.4.89. https://doi.org/10.1002/cphg.42

Otsu, N. (1979). A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics, 9(1) 62-69. https://doi.org/10.1109/TSMC.1979.4310076

Sezgin, M., & Sankur, B. (2004). Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation. Journal of Electronic Imaging, 13(1), 146-165. https://doi.org/10.1117/1.1631315

Nichele, L., Persichetti, V., Lucidi, M., & Cincotti, G. (2020). Quantitative evaluation of ImageJ thresholding algorithms for microbial cell counting. OSA Continuum, 3(6), 1417-1427. https://doi.org/10.1364/OSAC.393971

##submission.downloads##

Опубліковано

2022-04-15

Номер

Розділ

Оригінальні дослідження